張逸，魯雙云，高文娟，劉揚(yáng)，潘立群，何紅，顧海鷹
摘要:【目的】檢驗(yàn)粘克TM可吸收醫(yī)用膜是否符合生物材料的熱原要求，建立粘克TM可吸收醫(yī)用膜的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法?！痉椒ā堪础吨腥A人民共和國藥典》2005年版附錄及GB/16175一1996規(guī)定，同時(shí)采用熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對粘克TM可吸收醫(yī)用膜72h的浸提液樣品進(jìn)行檢測。【結(jié)果】該浸提液對細(xì)菌內(nèi)毒檢測不產(chǎn)生干擾，細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)結(jié)果為陰性。同時(shí)受試家兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.4℃?！窘Y(jié)論】粘克TM可吸收醫(yī)用膜不含引起機(jī)體發(fā)熱的內(nèi)毒素或致熱原，符合醫(yī)用生物材料的使用標(biāo)準(zhǔn)。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代家兔熱原法對該可吸收膜進(jìn)行熱原檢查是可行的。
關(guān)鍵詞:粘克TM可吸收醫(yī)用膜；家兔熱原試驗(yàn)；內(nèi)毒素試驗(yàn)
作為評價(jià)醫(yī)用生物材料生物學(xué)安全性指標(biāo)之一的熱原試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)是檢測其是否含有引起機(jī)體發(fā)熱的致熱原或內(nèi)毒素的方法。熱原試驗(yàn)?zāi)軌蛉鏅z出內(nèi)毒素所致或非內(nèi)毒素所致的熱原物質(zhì)，而內(nèi)毒素試驗(yàn)是利用賞的變形細(xì)胞與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，作為判斷樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否符合規(guī)定的一種方法。與家兔熱原試驗(yàn)相比，它具簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。內(nèi)毒素試驗(yàn)一般只用于某些大液體熱原的檢查。本文依照《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XID，XIE及GB/T16175一1996的標(biāo)準(zhǔn)要求，同時(shí)用熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對粘克TM可吸收醫(yī)用膜進(jìn)行檢測，研究能否用細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)替代家兔熱原試驗(yàn)進(jìn)行熱原檢測，以建立能夠快速檢測該可吸收醫(yī)用膜內(nèi)毒素的檢查方法。
1材料與儀器
1.1 試劑
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水):批號:060315規(guī)格:5
細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(RES):批號:2006一4 規(guī)格:160EU/支廠家:中國藥品生物制品檢定所
鱟試劑:批號:0602210 規(guī)格:0.25EU/ml，0.lml/支 廠家:湛江博康海洋生物有限公司。
1.2樣品
粘克TM可吸收醫(yī)用膜: 批號：02010406 規(guī)格:140mmx60mm，批號：03010626 規(guī)格:50mmx50mm 廠家:啟東致遠(yuǎn)生物科技有限公司（即現(xiàn)在由上海典范醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的粘克TM可吸收醫(yī)用膜）
1.3儀器
電熱恒溫?zé)峁娘L(fēng)干燥箱，型號:101AB-Z(上海華聯(lián)環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司恒昌儀器廠)，潔凈工作臺，型號:HS-1300(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，旋渦混合器，型號:XW-80A(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。
1.4實(shí)驗(yàn)動物
1.9-2.8kg家兔，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
2方法
2.1試驗(yàn)準(zhǔn)備
試驗(yàn)所用器材，經(jīng)180℃烘烤3h以上除去可能存在的外源內(nèi)毒素。
2.2粘克哪可吸收醫(yī)用膜浸提液的制備閣
將同一批號的粘克側(cè)可吸收醫(yī)用膜切成30mmx5mm條狀，置于去熱原的25ml錐形瓶中，按受試材料6cm2::1ml氯化鈉注射液的比例，取14ml氯化鈉注射液于錐形瓶中，置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中浸提72h。72h后將浸提液轉(zhuǎn)移至另一去熱原的錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值為7.0左右，4℃保存?zhèn)溆?。以上過程均在潔凈工作臺上按無菌操作要求進(jìn)行。
2.3鱟試劑靈敏度的復(fù)核
按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法復(fù)核鱟試劑靈敏度，結(jié)果見表1。所用上述批號鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，其靈敏度符合規(guī)定，可用于試驗(yàn)。
表一 靈敏度復(fù)核結(jié)果
|
批號 |
細(xì)菌內(nèi)毒素濃度（EU/ml） |
陰性對照 |
λ |
|||
|
0.5 |
0.25 |
0.125 |
0.0625 |
|||
|
0602210 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
-- |
0.125 |
2.4干擾預(yù)試驗(yàn)
取醫(yī)用膜浸提液，以BET水制成10倍、50倍、100倍系列稀釋溶液，用此系列溶液及浸提液原液作溶劑，溶解并稀釋內(nèi)毒素，以制成含細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品2入和0.25入兩個(gè)濃度的內(nèi)毒素溶液，用靈敏度為0.25EU/m1的賞試劑進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)作陽性和陰性對照。
2.5干擾試驗(yàn)
按《中華人民共和國藥典》進(jìn)行干擾試驗(yàn)。分別用BET水及浸提液原液將內(nèi)毒素配制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625EU/ml的溶液，同時(shí)用BET水和浸提液原液各做2管陰性對照，用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。
2.6樣品檢測
取醫(yī)用膜浸提液原液，按中國藥典進(jìn)行內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)。
2.7熱原檢查法
根據(jù)GB/T16175-1996熱原試驗(yàn)，在試驗(yàn)前7d選3只家兔，雌雄不限，雌兔無孕，且測溫前7d內(nèi)應(yīng)在同一環(huán)境條件用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間家兔體重?zé)o減輕，精神、食欲、排泄等無異常。預(yù)測體溫時(shí)用肛溫計(jì)插人家兔肛門，深度約6cm，時(shí)間為2min，取出肛溫計(jì)并記下讀數(shù)。每隔lh測量1次，共測4次，體溫均在38.0℃-39.6℃的范圍內(nèi)，且最高最低體溫的差數(shù)不超過0.4℃，符合熱原試驗(yàn)要求。
3d后將家兔固定于固定器內(nèi)。30min后開始第1次測量，以后每隔30min測1次，共測3次。體溫之差不超過0.2℃，以此3次體溫的平均值為該兔的正常體溫。且當(dāng)日使用家兔的體溫在38.0℃一39.6℃的范圍內(nèi)，各兔間正常體溫之差不超過1℃。在家兔正常體溫符合要求后15min內(nèi)，自耳靜脈緩慢注人預(yù)熱38℃醫(yī)用膜浸提液，劑量為10m/kg。注射后每隔lh測量體溫1次，3次體溫中最高的1次減去正常體溫為試驗(yàn)家兔體溫升高值，結(jié)果見表4。
3結(jié)果與討論
該醫(yī)用膜浸提液的原液和稀釋10倍、50倍、100倍液對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)均不產(chǎn)生干擾作用(見表2)。用原液做干擾試驗(yàn)，得到譽(yù)試劑Es值為0.125，在0.5λ~2λ范圍內(nèi)。Et分別為0.18和0.125，在0.5-2.OEs范圍內(nèi)，因此認(rèn)為醫(yī)用膜的浸提原液對內(nèi)毒素試驗(yàn)不產(chǎn)生干擾(見表3)。
表二 干擾預(yù)試驗(yàn)的測定結(jié)果
|
樣品批號 |
系列 |
稀釋倍數(shù) |
陽性對照 |
陰性對照 |
|||
|
原液 |
10倍 |
50倍 |
100倍 |
||||
|
02010406 |
樣品陰性對照 |
-- |
-- |
-- |
-- |
++ |
-- |
|
樣品陽性對照 |
++ |
++ |
++ |
++ |
|||
|
03010626 |
樣品陰性對照 |
-- |
-- |
-- |
-- |
++ |
-- |
|
樣品陽性對照 |
++ |
++ |
++ |
++ |
|||
表三干擾試驗(yàn)結(jié)果
|
樣品批號 |
系列 |
細(xì)菌內(nèi)毒素濃度（EU/ml |
陽性對照 |
陰性對照 |
靈敏度E（EU/ml） |
|||
|
0.5 |
0.25 |
0.125 |
0.0625 |
|||||
|
|
BET水 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
++ |
-- |
0.125 |
|
02010406 |
樣品 |
++++ |
++++ |
+--+ |
---- |
++ |
-- |
0.18 |
|
03010626 |
樣品 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
++ |
-- |
0.125 |
表四可吸收醫(yī)用膜細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果
|
樣品批號 |
樣品管 |
樣品陽性對照管（2λ） |
陰性對照管 |
陽性對照管（2λ） |
|
02010406 |
-- |
++ |
-- |
++ |
|
03010626 |
-- |
++ |
-- |
++ |
通過表4的內(nèi)毒素檢查結(jié)果可見該醫(yī)用膜的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是符合規(guī)定的。同時(shí)用家兔進(jìn)行熱原試驗(yàn)，由表5可見，3只家兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.4℃，熱原檢查符合規(guī)定，與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法結(jié)果一致。
表五 熱原試驗(yàn)結(jié)果
|
批號 |
兔號 |
體重 （kg） |
注射前體溫（℃） |
注射前體溫（℃） |
體溫升高值 |
結(jié)論 |
||||
|
第1次 |
第2次 |
第3次 |
第1次 |
第2次 |
第3次 |
|||||
|
02010406 |
1 |
2.6 |
39.5 |
39.5 |
39.6 |
39.6 |
39.5 |
39.6 |
0.1 |
合格 |
|
2 |
2.4 |
39.4 |
39.5 |
39.5 |
39.5 |
39.4 |
39.5 |
0.0 |
||
|
3 |
2.3 |
39.1 |
39.1 |
39.1 |
39.4 |
39.4 |
39.2 |
0.3 |
||
|
03010626 |
1 |
2.4 |
39.2 |
39.2 |
39.2 |
39.4 |
39.2 |
39.4 |
0.2 |
合格 |
|
2 |
2.3 |
39.5 |
39.5 |
39.3 |
39.2 |
39.2 |
39.1 |
0.0 |
||
|
3 |
2.4 |
39.4 |
39.3 |
39.3 |
39.2 |
39.1 |
39.2 |
0.0 |
||
4結(jié)論
本試驗(yàn)同時(shí)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和熱原檢查法檢查粘克哪可吸收醫(yī)用膜是否含有引起機(jī)體發(fā)熱的內(nèi)毒素或致熱原。兩種方法的檢查結(jié)果一致，均為陰性，因此判定該醫(yī)用膜不含引起機(jī)體發(fā)熱的內(nèi)毒素或致熱原，符合醫(yī)用材料的使用標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)說明用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代家兔熱原法對該可吸收醫(yī)用膜進(jìn)行熱原檢查是可行的。
參考文獻(xiàn):
【1】中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.附錄XIE，85一88.
【2】中國標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.GB理16175一1996醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評價(jià)試驗(yàn)方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003:熱原試驗(yàn)，16一17.
【3】中國標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.GB理16886.12一20(X]醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003:第12部:樣品制備與參照樣品，191一192.
(收稿日期:2006-11-20)
選自《現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)》2007年第34卷第18期